携带bcl-2基因慢病毒感染人原代卵巢颗粒细胞的凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.018

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (28): 5209-5215.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.018

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携带bcl-2基因慢病毒感染人原代卵巢颗粒细胞的凋亡

王雪峰，谭峰，陈燕英，刘木彪，何援利

南方医科大学附属珠江医院妇产科，广东省广州市 510282

出版日期:2013-07-09 发布日期:2013-07-09
通讯作者: 何援利，硕士，主任医师，南方医科大学珠江医院妇产科，广东省广州市 510282
作者简介:王雪峰，女，1977年生，黑龙江省齐齐哈尔市人，汉族，2009年南方医科大学毕业，博士，硕士生导师，副主任医师，主要从事生殖内分泌的研究。douwangxuefeng@163.com
基金资助:
2010年国家自然科学基金(81041101)；
2010年广东省自然科学基金(10451051501004704)；
2011年广州市科技计划项目( 2011J4100087)。

Apoptosis of human primary ovarian granulose cells infected with lentivirus carrying bcl-2 gene

Wang Xue-feng, Tan Feng, Chen Yan-ying, Liu Mu-biao, He Yuan-li

Department of Gynaecology and Obstetrics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China

Online:2013-07-09 Published:2013-07-09
Contact: He Yuan-li, Master, Chief physician, Department of Gynaecology and Obstetrics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
About author:Wang Xue-feng, M.D., Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Gynaecology and Obstetrics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China douwangxuefeng@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China in 2010, No. 81041101*;
the Natural Science Foundation of Guangdong Province in 2010, No. 10451051501004704*;
the Science and Technology Program of Guangzhou in 2011, No. 2011J4100087*

摘要/Abstract

摘要：

背景：慢病毒可以感染分裂及非分裂细胞，对于较难转染的原代卵巢颗粒细胞，慢病毒能否成功进行感染？

目的：探讨携带bcl-2基因的慢病毒感染原代人卵巢颗粒细胞的效率及对细胞凋亡的影响。

方法：利用分子生物学技术，构建携带bcl-2基因慢病毒载体，包装成高滴度慢病毒，将重组慢病毒在体外分别以不同感染复数(10，50，100，200，400)感染人卵巢原代颗粒细胞，感染24，48，72，96 h后观察感染效率及细胞增殖情况，同时采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，利用反转录聚合酶链反应检测bcl-2基因的转录情况。

结果与结论：原代培养人卵巢颗粒细胞24 h即贴壁，集落样生长，呈多角形或梭形；当感染复数为100时，细胞的形态和生长不受影响，且感染效率较高，感染后72 h达高峰，其在颗粒细胞中的阳性率达60%；携带bcl-2基因的慢病毒感染原代培养的人卵巢颗粒细胞，可以过度分泌Bcl-2蛋白，能抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, bcl-2基因, 慢病毒, 卵巢颗粒细胞, 细胞凋亡, 基因转染, 载体构建, 卵巢早衰, 增强型绿色荧光蛋白基因, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Lentivirus can infect divided and undivided cells. It remains uncertain whether the lentivirus can successfully infect primary ovarian granulosa cells.

OBJECTIVE: To investigate infecting ratio and cell apoptosis of lentivirus carrying bcl-2 gene in primary human ovarian granulose cells cultured in vitro.

METHODS: The lentiviral vector carrying bcl-2 gene was constructed using molecular biology, and packaged into lentivirus with high titer. The resulting recombinant lentivirus carrying bcl-2 genes were then used to infect primary human ovarian granulosa cells in vitro at different multiplicity of infection, 10, 50, 100, 200, and 400. Infection efficiency and cell proliferation were observed at 24, 48, 72, and 96 hours following infection. Cell apoptosis was detected by flow cytometry, and bcl-2 gene transcription was assessed using reverse transcription PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: Primary human ovarian granulosa cells adhered at 24 hours, and exhibited polygon- or fusiform-shape and colony-like growth. When multiplicity of infection was 100, cell appearance and growth remained unchanged, and infection efficiency was high, which reached the peak up to 72 hours. Moreover, the positive rate was up to 60% in granulosa cells. Lentivirus carrying bcl-2gene could increase expression of Bcl-2 protein and inhibit apoptosis of primary ovarian granulosa cells.

Key words: tissue construction, cytology experiment in tissue construction, bcl-2 gene, lentivirus, ovarian granulosa cells, cell apoptosis, gene transfection, vector construction, premature ovarian failure, enhanced green fluorescent protein gene, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

王雪峰，谭峰，陈燕英，刘木彪，何援利. 携带bcl-2基因慢病毒感染人原代卵巢颗粒细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(28): 5209-5215.

Wang Xue-feng, Tan Feng, Chen Yan-ying, Liu Mu-biao, He Yuan-li. Apoptosis of human primary ovarian granulose cells infected with lentivirus carrying bcl-2 gene[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(28): 5209-5215.

图/表（结果） 5

2.1 重组慢病毒滴度及感染效率的测定 见图1。

培养的卵巢颗粒细胞24 h即贴壁，集落样生长，呈多角形或梭形，见图1A。扩增纯化后获得的重组慢病毒pGC-FU-bcl-2及空载慢病毒pGC-FU-EGFP的滴度分别为5.06×10¹² U/L和6.73×10¹² U/L。采用不同感染复数感染卵巢颗粒细胞，培养24，48，72 h后在荧光显微镜下观察卵巢颗粒细胞的感染效率，结果可见：感染 24 h后，在荧光显微镜下可以看到EGFP的表达呈阳性，之后逐渐增强，至72 h后其绿色荧光的表达呈高峰。病毒感染复数分别为10，50时，慢病毒感染细胞的效率较低，见图1B，C，感染复数为100时，感染效率较高，且细胞的形态和生长不受影响，其在颗粒细胞中的阳性率达60%，见图1D。感染复数为200和400时，细胞病理现象明显，细胞变圆，漂浮，细胞的正常增殖受影响。因此，后续实验中的感染率及其余指标均在感染复数为100的条件下测定。 2.2 RT-PCR检测重组慢病毒pGC-FU-bcl-2中bcl-2基因的转录 用Trizol试剂盒提取感染重组慢病毒pGC-FU-bcl-2的卵巢颗粒细胞总RNA，经DNaseⅠ处理后行RT-PCR，并用RNA直接PCR和空载慢病毒pGC-FU-EGFP的cDNA产物作阴性对照。结果可见，pGC-FU-bcl-2感染的卵巢颗粒细胞有bcl-2片段的扩增；而pGC-FU-EGFP无特异性条带产生，表明插入的目的基因bcl-2在mRNA水平能有效转录，见图2。

2.3 重组慢病毒pGC-FU-bcl-2介导基因体外表达 以感染复数为100的pGC-FU-bcl-2感染人卵巢颗粒细胞，用抗Bcl-2对表达产物进行免疫印迹检测分析发现，实验组有Bcl-2蛋白的表达，而空白对照组和空载体组呈阴性，见图3。在相对分子质量约53 000处显示特异性蛋白条带，其大小与bcl-2-EGFP融合基因产物的相对分子质量一致，随着时间的延长，第7天比第3天条带灰度明显增强，证明bcl-2基因能够被重组慢病毒载体转入靶细胞人卵巢原代颗粒细胞，并且持续表达。

2.4 流式细胞仪检测人卵巢颗粒细胞凋亡情况 见表1。

流式细胞仪检测结果显示空白对照组凋亡峰不明显，颗粒细胞凋亡率为(1.96±0.23)%，见图4A，实验组(颗粒细胞+pGC-FU-bcl-2)出现微弱的凋亡峰，颗粒细胞凋亡率为(2.35±0.18)%，见图4B，明显比空载对照组(颗粒细胞+pGC-FU-EGFP)低(P < 0.05)，但与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。空载对照组(颗粒细胞+pGC-FU-EGFP)出现明显凋亡峰，颗粒细胞凋亡率为(6.88±0.27)%，见图4C。表明空载慢病毒在体外对卵巢颗粒细胞有一定的毒性，能诱导原代颗粒细胞凋亡，但慢病毒介导bcl-2基因则可以抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。

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引言

材料方法

设计：分子基因水平的对比观察实验。

时间及地点：实验于2007年5月至2009年12月在中山大学生命科学院完成。

材料：

细胞和质粒：慢病毒表达载体穿梭质粒pGC-FU(含EGFP基因)和慢病毒结构质粒pHelper1.0及慢病毒包膜蛋白质粒pHelper2.0(Genechem公司)；bcl-2基因表达质粒(购买于openbiosystems公司，货号为EHS1001-4992520)；人胚肾上皮细胞系293T细胞(中山大学分子医药生物学实验室)。

试剂和引物：AgeⅠ，T₄DNA ligase，T₄ DNA ligase buffer(Neb公司)；Taq polymerase(Takara公司)；Plasmid抽提kit(Qiagen公司); Lipofectamine 2000 (Invitro-gen公司)；感受态大肠埃希菌DH5α(中山大学分子医药生物学实验室制备)；锥虫蓝(上海捷备思基因技术有限公司)；胎牛血清(上海微科生化试剂有限公司)；二甲基亚砜(上海生化试剂厂)；DMEM(GIBCO公司)；胰酶(上海化学试剂公司)；prmier(中山大学分子医药生物学实验室合成)。

人卵巢颗粒细胞：取自于南方医科大学附属南方医院生殖中心。实验使用的所有细胞均征得患者及家属的同意，并签署知情同意书。

方法：

携带bcl-2基因重组慢病毒的包装及鉴定：经过限制性酶切成功构建携带bcl-2基因慢病毒表达载体质粒，命名为pGC-FU-bcl-2，将pGC-FU-bcl-2和两种辅助包装元件pHelper1.0、pHelper2.0分别进行高纯度无内毒素质粒抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染包装293T细胞，获得携带目的基因bcl-2和空载的重组慢病毒GC-FU-bcl-2，GC-FU-EGFP，对其浓缩后得到高浓度的慢病毒浓缩液^[6]。经过倍比稀释法测定病毒的滴度为10¹¹ U/L。将293T细胞接种于6孔板，每孔细胞数为4×10⁵，培养24 h后，换无血清的培养液，加入感染复数(MOI值)为10的重组慢病毒GC-FU-bcl-2 (实验组)，同时设立GC-FU-EGFP空载体对照组进行鉴定。

人卵巢原代颗粒细胞培养：人卵巢颗粒细胞取自于南方医科大学附属南方医院生殖中心。促排卵治疗采用促性腺激素释放激素激动剂/卵泡刺激素长方案^[7]，B超检测卵泡发育情况，当主导卵泡直径≥18 mm时，停止使用促性腺激素释放激素激动剂和卵泡刺激素，肌注绒毛膜促性腺激素10 000 U，36 h后经阴道超声穿刺取卵。回收卵子后尽量留取无血污染的卵泡液。卵泡液室温下2 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀黄素化颗粒细胞，重新用D-Hank平衡液悬浮，等量加入淋巴细胞分离液，2 240×g梯度离心20 min。仔细吸取二液体中间层颗粒细胞，D-Hank平衡液离心洗涤二三次，用0.1%胶原蛋白酶消化10 min，含体积分数为10%胎牛血清的HTF培养液终止反应。在光学显微镜下鉴定为多边形有伪足的颗粒细胞，经锥虫蓝染色，细胞存活率>90%。每孔接种细胞浓度为4×10³/孔-1×10⁴/孔，反复吹打均匀，每孔含DMEM-Ham’s F12培养液(另含体积分数为10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素 100 mg/L)。置37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱中培养18 h，待细胞贴壁后更换无血清培养液。

重组慢病毒感染效率的测定：取培养的人卵巢原代颗粒细胞，显微镜下观察细胞密度，当达到1×10⁶/孔，选定预期感染进入细胞中的病毒颗粒数，即感染复数为10，50和100，200，400，将相应感染复数的病毒液pGC-FU-bcl-2及pGC-FU-EGFP，分别感染人卵巢原代颗粒细胞，37 ℃感染6 h后，添加10%DMEM继续培养，并于24，48，72，96 h光学显微镜下观察细胞增殖情况及计数EGFP阳性细胞百分率。

重组慢病毒GC-FU-Bcl-2在人卵巢原代颗粒细胞中的表达：将人卵巢颗粒接种后培养24 h，换无血清的培养液，加入感染复数为100的重组慢病毒GC-FU-bcl-2 (实验组)，同时设立不加病毒的空白对照组和GC-FU-EGFP空载体对照组。分别于转染后3-7 d荧光显微镜观察，Western blotting分别检测第3，7天目的基因bcl-2在人卵巢原代颗粒细胞中的表达。

流式细胞仪检测细胞凋亡：将各组的颗粒细胞加入Annexin V标记蛋白和相应的核酸染料，均匀混合，室温避光反应15 min；向流式管中加入400 µL 1×的结合缓冲液，重悬后及时上流式细胞仪进行分析，采集细胞的DNA 数据，并以 wincycle3.0 软件进行数据分析处理。

RT-PCR检测感染人卵巢原代颗粒细胞中的bcl-2的转录：按Trizol试剂盒说明书，从3.0×10⁵人卵巢原代颗粒细胞中提取总RNA，利用反转录试剂盒以Bcl-2下游引物P2：5’- TCA CTT GTG GCC CAG GTA TGC-3’(由上海英骏生物公司合成)进行反转录，以获得的cDNA为模板，用上述配对引物经PCR扩增目的条带。

Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2的表达：各组反应体系离心(3 000 r/min，5 min)，弃上清，在沉淀中加入细胞裂解液，置冰上反应40 min，每5 min振荡1次，每次30 s。然后12 000 r/min，4 ℃离心15 min，收集上清液，即为提取的蛋白质。用蛋白定量测定试剂盒进行总蛋白测定，获得每个组织的总蛋白浓度，按总蛋白上样量50 g计算出每个组织的上样量。置备10%的SDS-PAGE分离胶，以β-actin为内参照，取等量蛋白，与5×上样缓冲液( 0.1 mmol/L tris-HCl，pH 6. 8，50%丙三醇，0.5%溴酚蓝，5% β-琉基乙醇，10%SDS )混合，95 ℃加热10 min使蛋白变性。冷却后，用微量加样器依次加入加样孔内，与聚丙烯酰胺凝胶电泳4 h，电压为40 V，半干转移至硝酸纤维素膜上。将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有100 g/L脱脂奶粉的PBS中，在室温下脱色摇床上摇动封闭1 h，分别加入Bcl-2一抗(1∶1 000)，β-actin(1∶3 000，Sigma)4 ℃过夜，以辣根标记的二抗(1∶1 000)杂交，室温孵育1 h，用PBS-T洗5 min/次，3次。暗室中增强化学发光，压胶片曝光。蛋白的表达水平根据看家基因β-actin进行标化。通过BandScan5.0软件分析目的条带进行灰度扫描、定量，比较各组蛋白表达差异，每组重复5次。

主要观察指标：重组慢病毒感染卵巢颗粒细胞的效率，卵巢颗粒细胞凋亡率，Bcl-2蛋白定量及基因转录情况。

统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，用SPSS13.0统计软件处理，2组间比较采用独立样本t检验，3组及3组以上的比较采用单向方差分析(One way ANOVA)，如方差齐，多重比较采用LSD分析；如方差不齐，Welch法校正后采用DunnettT3分析。同一组内不同时间点比较，采用重复测量数据的方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

基因治疗的开展为卵巢早衰难治性疾病的治疗带来了新希望。腺病毒载体是最早应用于基因治疗的病毒载体。由于腺病毒载体不能整合入宿主染色体，所以目的基因只能暂时表达，一般只能维持1个月左右，如需长期持续起作用时需要重复给药^[8]。来源于人类免疫缺陷病毒1 (HIV-1)的慢病毒载体为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒载体能够整合到宿主细胞的基因组，感染分裂期和非分裂期细胞，实现目的基因的稳定表达，且具有感染效率高、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应低等特点^[9-10]，成为基因治疗首选的载体。实验中作者构建了带有报告基因绿色荧光蛋白的慢病毒载体，在实验过程中便于观察，无需引入其他示踪剂，在活细胞内就可通过显微镜直接观察表达情况，在实验中慢病毒载体可有效转染体外培养的原代卵巢颗粒细胞，在感染的24 h即可观察到绿色荧光蛋白的表达，随着时间延长，绿色荧光蛋白的表达越来越强，至1周时表达最强，由于原代培养的卵巢颗粒细胞在体外存活时间短，实验仅能观察到2周，无法观察到绿色荧光蛋白最长可以表达多长时间，很多利用细胞株进行慢病毒转染研究结果表明，慢病毒在体外培养的细胞及动物体内可以长期持久表达，甚至能够通过繁衍传给子代，一方面，由于慢病毒可以整合至宿主的DNA中，另一方面，实验使用的慢病毒载体中含有泛素启动子，泛素启动子在增强基因表达的长期性和稳定性等方面有显著功效。它在真核细胞中的强启动作用不仅与其核心区域的多种转录因子有关，也与其5’UTR的内含子调控作用密不可分，能显著提高目的基因的表达水平及表达持续时间^[11-13]。病毒载体的共同缺陷通常具有免疫原性，既往的病毒载体通常具有较多的自身序列，往往引起较重的免疫反应，但是随着病毒载体的不断加工、改进，新一代的病毒载体引起的细胞免疫反应越来越轻。慢病毒既能够感染分裂细胞，又能够感染非分裂期细胞，如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等，而且较腺病毒载体的免疫反应小、可重复应用，其转移基因片段容量大，可达10 kb，并能实现目的基因的稳定表达^[14-15]，有报道可长达2个月，国内外文献中尚未见报道感染卵巢细胞的研究。实验应用第4代慢病毒载体质粒经过限制性内切酶构建携带bcl-2重组质粒，共同转染293T细胞后包装成较高滴度的慢病毒颗粒。利用感染复数为100的慢病毒来感染人卵巢原代颗粒细胞，尽管原代细胞培养过程繁琐，但原代培养的细胞更能反映细胞在活体组织内自身的特性，更具有临床研究价值，因原代细胞实验耗时长，培养难度大，质粒转染效率低^[16-17]，所以国内外研究报道较少。在预实验中发现重组慢病毒质粒载体在没有包装成慢病毒之前利用脂质体转染效率只有10%左右，但把3个质粒共转染293T细胞后，包装成慢病毒，并经高速离心浓缩成高滴度的病毒，以感染复数为100感染细胞的效率可以使人卵巢原代颗粒细胞被感染的效率增加，达到60%左右，且细胞生长的状态不受明显的影响，且越高感染复数病毒转染效率越高，但对卵巢颗粒细胞的毒性也随之增强。利用慢病毒介导基因的转移，不需要脂质体包裹，操作简单，对细胞毒性小，适于细胞生物学的实验研究。另有研究报道重组慢病毒质粒经过包装后，不仅转导效率显著提高，而且携带的目的基因可以通过病毒感染整合到细胞基因组中，并随细胞分裂而传代，子代细胞的基因过表达效果更明显^[18-19]。如果用这种细胞筛选出稳转细胞株后进行基因的功能研究，可非常方便地进行长时间的观察和动物实验，国内外尚未见相关报道。细胞凋亡是受基因调控的精确过程，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因，bcl-2是其中研究较多的且抗凋亡作用较强的基因之一，是目前公认的人体长寿基因^[20-23]。一般认为bcl-2基因通过抗细胞凋亡在肿瘤的发生中起作用。研究发现寿命长的细胞中bcl-2的表达含量也高。bcl-2不仅存在于B细胞淋巴瘤中，也存在于许多正常组织和胚胎组织中。检测bcl-2产物在人体各类细胞中的表达，发现寿命长的细胞中bcl-2的表达含量也高^[24-26]。1988年Veux首先研究了Bcl-2蛋白功能，发现Bcl-2的过度表达使前B细胞在去除生长因子后寿命增加。利用转基因方法，使细胞内Bcl-2蛋白水平增高，再用反转义技术减少Bcl-2的表达，则加速了细胞死亡^[24]。体外培养的交感神经细胞，在中断神经生长因子供给的条件下，Bcl-2过量表达能够阻止细胞凋亡^[27]。鼠胚胎成纤维细胞系等转染外源bcl-2基因后，被转染细胞的生长周期被阻滞在G₀/G₁期，细胞寿命明显延长^[28-29]。卵巢是由一个整个生命周期不断进行连续修复的动态系统，细胞凋亡是维持这个动态修复系统的重要机制^[30-32]，在卵泡发育过程中，颗粒细胞的增殖、分化起着重要的作用，颗粒细胞大量凋亡将会影响卵泡的正常发育成熟过程，颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的重要直接原因^[33-35]。人们对鼠、人、猴的一系列研究发现，bcl-2家族成员Bax在mRNA和蛋白表达水平的升高与颗粒细胞死亡及卵泡闭锁存在持续关系^[36-37]。研究发现在人类卵巢颗粒细胞的凋亡被皮质激素所抑制时，细胞内bcl-2的含量增高达3.0-7.6倍，证明了bcl-2能抑制颗粒细胞凋亡，促进卵泡的生长和排卵^[38]。其不少学者将特定分泌蛋白基因，如抗凋亡因子通过脂质体或腺病毒介导，转染体外培养的卵巢颗粒细胞，但由于脂质体及腺病毒的毒性及免疫原性较强，导致细胞凋亡比率明显增加^[39]。而该实验将抗凋亡基因bcl-2搭载于慢病毒载体上，再感染原代培养的人卵巢颗粒细胞，被转染的细胞可以作为“工厂”，持续“生产”特定的抗凋亡蛋白。它们被分泌培养液中进一步保护颗粒细胞抵抗外界各种理化因素的影响。实验在分子基因水平上干预颗粒细胞凋亡，结果证实通过慢病毒上调抗凋亡基因bcl-2产物，使体外培养的人原代卵巢颗粒细胞的凋亡率接近正常卵巢颗粒细胞的自然凋亡率，同时也表明携带EGFP的空载慢病毒对体外培养的卵巢颗粒细胞具有一定的毒性，随着作用时间的延长及病毒滴度的增加，颗粒细胞的凋亡率明显增加，提示抗凋亡蛋白Bcl-2的过度分泌是抑制颗粒细胞凋亡的根本原因，为进一步研究对卵巢颗粒细胞体外分泌雌激素的影响奠定基础。

携带bcl-2基因慢病毒感染人原代卵巢颗粒细胞的凋亡

Apoptosis of human primary ovarian granulose cells infected with lentivirus carrying bcl-2 gene

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